1/Materials and Equipment
（1）24-well plates和96-well-plates（U型底）
（2）DMEM
（3）PBS
（4）DMEM完全培养基（DMEM +10% FBS +1% Pen Stre）
（5）FACS buffer（PBS +2% FBS +1% Pen Stre）用前配制
（6）BDCytofix/Cytoperm
（7）BDPerm/Wash (10×)/ 稀释后使用/
2/Procedure
Day 1
铺板
收集细胞，计数铺24孔板（1/0-1/5×105/well，1ml培液），37℃ 5% CO2培箱过夜。
Day 2
Ligand***、破坏高尔基体
（1）用无血清DMEM稀释Ligands后滴入孔板，8字晃匀，培箱孵育30 min；
例：母液浓度为5 mg/ml的LPS，需使其工作浓度为50 ng/ml，则先1/500稀释，5 μl/well加入稀释液（1：200），此时终稀释比为1/100/000
（2）（孵育期间）取出GolgiPlug（BFA）化冻，化冻需要大约30 min。用无血清DMEM稀释后滴入孔板（加入孔板后的终稀释比为1/1000），8字晃匀，培箱孵育6/5 h；
例：BFA 1/10稀释，10μl/well（1/100）加入稀释液
转移细胞至96孔板/死细胞染色
（1）吸去24孔板中的培液，用PBS 500 μl/well润洗细胞，200 μl/well预冷的PBS吹下细胞，悬液转移至U底96孔板（加入预冷PBS后可在4℃静置10min，更易吹下细胞）96孔板每孔不超过5*10^5
（2）1300 rpm，4℃离心8 min；
（3）（离心期间）用PBS1/1000稀释死细胞染料（LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Dye）；
（4）离心结束后翻倒去上清，每孔50 μl死活染料稀释液重悬细胞，排***吹打10次；
（5）4℃ 避光孵育30 min；
（6）1300 rpm，4℃离心8 min，翻倒去上清；
（7）每孔200 μl PBS 重悬细胞，1300 rpm，4℃离心8 min，翻倒去上清；
重复（7）
固定、透化和洗涤
（1） 每孔加入100~150 μl（取决于细胞量） BDCytofix/cytoperm重悬细胞；
（2） 严格4℃避光静置20 min；
（3） （静置期间）配1X Perm Wash；
例：配50 ml 1X PermWash，在50ml离心管中加入5 ml 10×Perm Wash，加ddH2O至50ml
（4） 1600 rpm，4℃离心6 min（后续所有离心均为此设置），翻倒去上清，
（5） 200 μl/well 1X Perm Wash 重悬细胞，再次离心，翻到去上清
（6） 重复（5）；
Fc block和细胞因子染色
（1）（离心期间）用1×Perm/Wash 1/250稀释Fc block；
例：如需配制10 well Fcblock，取2 μl Fc block加入500 μl 1×Perm/Wash
（2）50 μl/well Fc block稀释液重悬细胞，4℃避光孵育20 min；
（3）（孵育期间）用1×Perm/Wash 1/250稀释细胞因子荧光抗体（TNFa-APC）
例：如需配制10 wellTNFa-APC，取2 μl Fc block加入500 μl1×Perm/Wash
（4）50 μl/well 加入细胞因子抗体，用排***吹打（此时孔内液体体积为100 μl）
（5）4℃ 避光染色30 min；
（6）离心，翻倒去上清；
（7）200 μl/well FACS buffer重悬细胞，离心，翻到去上清；
（8）重复（7）；
（9）200 μl/well FACS buffer重悬细胞，将细胞转移至流式管中，流式管中补加400~600 μl（微流式管中终体积不要超过700 μl，如用更大体积需使用5 ml流式管） FACS buffer，4℃避光保存至上机
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