什么是2A肽：
2A肽是来源于病***的短肽，一般为18至25个氨基酸，也被称为“自我剪切”肽。
2A肽功能：
2A肽能够使一条转录产物产生多种蛋白，即使融合蛋白通过2A肽自我切割分离，产生多种蛋白质***地行使各自的功能。2A肽能够实现多基因共表达、蛋白质分离表达、蛋白质功能恢复，并且在抗体制备和病***学研究中具有重要意义。
2A肽作用机制：
2A肽介导的自我剪切机制是核糖体在2A肽翻译过程中跳过C端形成的甘氨酰-脯氨酰（GP）肽键。
2A肽有哪些：
目前常用的2A肽有4种：P2A、T2A、E2A和F2A。
1/ P2A，来源于猪捷申病***（porcine teschovirus），氨基酸序列为：（GSG）ATNFSLLKQAGDVEENPGP
2/ T2A，来源于明脉扁刺蛾病***（Thosea asigna virus），氨基酸序列为：（GSG）EGRGSLLTCGDVEENPGP
3/ E2A，来源于马甲型鼻炎病***（Equine rhinitis A virus），氨基酸序列为：（GSG）QCTNYALLKLAGDVESNPGP
4/ F2A，来源于***病***（Foot and mouse disease virus），氨基酸序列为：（GSG）VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
图1：4种常用的2A肽氨基酸序列
通常来说，在使用单个2A肽的情况下，P2A的切割效率最高，几乎可以达到100%。其次是T2A，再次是E2A和F2A，F2A的切割效率一般为50%左右。但是，在串联使用多个2A肽的情况下，还不能简单地认为将多个P2A或T2A串联起来就能达到最大的切割效率，这需要实验来验证。
另外，夏威夷大学马诺阿分校的Wei Wen Su等人发现了两种来源于紫海胆（紫胆）和加利福尼亚海虫（加利福尼亚海兔）的2A肽，分别命名为SP2A和AC2A。这是科学家们首次发现的非病***来源的2A肽。
图2：SP2A和AC2A氨基酸序列
近日，来自耶鲁大学的Yuan Ren等人阐明了来自马乙型鼻炎病***（Equine rhinitis B virus 1，ERBV-1）的2A肽切割效率也可以达到70-99%。
2A肽在真核表达载体构建中的应用案例：
Jin Hee Kim等人将NLS-EGFP-2A-mCherry-CAAX串联表达，通过WB和免疫荧光验证了4种不同2A肽的切割效率。结果表明：切割效率：P2A＞T2A＞E2A＞F2A。免疫荧光结果结果表明，P2A能够很好地将EGFP和mCherry在空间上分离开来，因为EGFP融合了NLS，因此定位在细胞核内，而mCherry的C末端添加了CAAX异戊二烯化基序，因此能够定位在细胞质膜上。作者进一步验证了2A肽在人源，鼠源和斑马鱼细胞系上的切割效率，其结果一致。
图3：真核载体构建示意图
图4：P2A在HEK293T细胞中的切割效率最高
2A肽在病***学研究中的应用案例1-GFP报告流感病***的构建：
Balaji Manicassamy等人将流感病***NS1和GFP融合表达，在GFP的C末端添加P2A肽，从而将NS1-GFP和NEP蛋白分离开来。用次方法他们成功构建了NS1-GFP融合表达的重组病***。该法构建的报告病***对小鼠的致病性有所降低，因此在建立小鼠感染模型时，需要提高攻***剂量。该放构建的GFP报告病***能够应用于小鼠***病***成像和抗病***药效评价。
图5：携带GFP报告基因的重组流感病***的构建
图6：NS1-GFP病***的体内特性
2A肽在病***学研究中的应用案例2-蓝耳病***DNA***的构建：
Sochanwattey Meas等人将蓝耳病***的GP5、M和N基因串联表达，中间用P2A和F2A组合的方式将不同的产物分离开来。用此方法构建的表达载体能够成功地同时表达GP5、M和N三个蛋白。2A肽的应用为DNA***的构建提供了新的思路。
图7：三顺反子基因构建示意图
图8： GP5、M和N蛋白表达
参考文献
1/ High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from PorcineTeschovirus-1 in Human Cell Lines/ Zebrafish and Mice
2/ Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice usinga GFP reporter virus
3/ Production of an antibody Fab fragment using 2A peptide in insect cells
4/ Non-viral 2A-like sequences for protein coexpression
5/ Co-expression of self-cleaved multiple proteins derived from PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus by bi-cistronic and tri-cistronicDNA vaccines
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