1、人源杀菌肽 编者按：本文主要从引言；材料和方法；结果；讨论，对人源杀 菌肽进行讲述。其中，主要包括：人类惟一的cathelicidingene所编码 的蛋白质为 hCAPl&hum3nC3tionic3ntimicrobialproteinl8)丄L37 是 Cthelincidin蛋口 hCAP18C端的37个氨基酸片段，为Mr4/5xl03的阳离 子两性分子a螺旋抗菌肽，其氨基酸残基序列为 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES、材料 BL21star 菌、 pET30a(+)/ pMD18T 和鼠抗 6xHismAb 购自 ROCHE 公司；DH5a
2、菌由 本研究所保存；ExTaq/ Sac0/ Hindi?/ Fxe裂解试剂盒购自TaKaRa公 司；6xHis亲和纯化TALON柱芯及强离子交换柱芯MacroPrepHighS分 别购自Clontech公司和BioRad公司；改良杀菌肽LL37的DNA序列为 木所构建/、lrLL37多肽融合表达质粒的构建将本所己构建的改良杀 菌肽LL37的DNA序列经27g/L凝胶电泳、纯化，以连接试剂盒(TAKARA) 连接入PMD18T载体并转入感受态DH5a菌中，铺LB板(含Xgal0/04g/L/ IPTG0/024g/L/ AmpO/lg/L)进行蓝口斑筛选，测序正确的单菌落进行 扩增、抽质粒，并
3、进行双酶切(S3雷及HincO)和凝胶电泳、纯化、 临***抗生素的广泛大量使用，导致严重的致病菌耐药性问题杀菌肽 (又称抗菌肽、肽抗生素)为一类广泛存在于许多生物中的内源性杀 菌多肽/其作用特点在于既不容易导致耐药菌株的产生，又具有广谱 抗微生物作用，因而具有极高的应用价值，具体材料请详见： 0引言 人类惟一的cathelicidingene所编码的蛋白质为 hCAPl8(humanC3tionicQntimicrobiQlpotein28)/LL37 是 Cthelincidin 蛋白 hCAP18C端的37个氨基酸片段，为Mr4/5xl03的阳离子两性分子a螺 旋抗菌肽，其氨基酸残基序列为
4、LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES 1-2丄L37 抗菌力较昆虫 细胞源性抗菌肽的杀菌力弱/最新分离出恒河猴的同源蛋白RL37与 LL37同源性很高/其净正电荷为+&而LL37为+5/8/ RL37的抗菌活性要 高于 LL37 3-4/ 根据 SAR (structureactivityrelationship)研究显示所有 a 螺旋抗 菌肽的抗菌活性和抗菌普与肽链中所带正电荷、疏水性氨基酸数目密 切相关，通过分子改造增加LL37肽链中正电荷的氨基酸和碱性氨基 酸数目，而不改变其a螺旋构象来提高其抗菌活性是一种较好的途径 5-6/本实验室对LL37进行改
5、良/将Glul6/Asp26/Glu36分别替换 为Glnl6/ Asn26/ Gln36/净电荷由+5/8提高至+9/经PCR获得编码改 良LL37的DNA全长基因片段，并且所设计的DNA序列中其引导序列 含有凝血因子X3酶切位点和带负电荷的承载蛋白/我们通过构建适宜 的表达载体、采用融合肽形式以大肠杆菌表达rLL37/将其***到含 有6xHis的特异亲和纯化标志序列的表达载体PET30a ( + )中，从而 在E/coli中表达岀能被正确切割产生有抗菌活性的融合蛋口 7-8/ 1材料和方法 2/2 材料 BL21star 菌、pET30a(+)/ pMD18T 和鼠抗 6xHismAb 购
6、自 ROCHE公司；DH5a菌由木研究所保存；ExTaq/ Sact?/ HincO/ Fxq裂 解试剂盒购自TaKaRa公司；6xHis亲和纯化TALON柱芯及强离子交换 柱芯MacroPrepHighS分别购自Clontech公司和BioRad公司；改良杀 菌肽LL37的DNA序列为本所构建/ 1/2方法 1/2/1rLL37多肽融合表达质粒的构建将本所己构建的改良杀菌肽 LL37的DNA序列经17g/L凝胶电泳、纯化，以连接试剂盒(TAKARA) 连接入PMD18T载体并转入感受态DH5a菌中，铺LB板(含Xgal0/04g/L/ IPTG0/024g/L/ AmpO/lg/L)进行蓝口
7、斑筛选，测序正确的单菌落进行 扩增、抽质粒，并进行双酶切(S3出及Hind酊 和凝胶电泳、纯化/纯 化后的目的片段与同样处理的载体pET3Oa+连接，转入DH5e菌，铺 LB板(含Amp20mg/L)进行抗性筛选，将单菌落进行扩增后抽提质 粒、PCR鉴定及测序鉴定/ 1/2/2表达条件及产物的亲和纯化将鉴定正确的融合蛋口表达质 粒PET30a(+)电转化入工程表达菌BL21star(DE3)/挑取Kan抗性菌落， 扩大培养于含30mg/LKan的LB培养基中/370振荡培养至A600nm为 0/60/8时/加入IPTG至终浓度为lmmol/L诱导表达8h/ 14000g离 心5min收集菌体，超声破碎细胞包涵体，21000g离心20min/离心后 上清可溶性蛋口经TALON柱芯亲合纯化，沉淀包涵体蛋口经6mol/L 的***II瓜溶解后经TALON柱芯亲合纯化，将可溶性蛋口及溶解后的 包涵体分别以5mmol/L的咪卩坐洗涤杂蛋白，然后用 150/300/500mmol/L的咪哇梯度洗脱目的蛋口，少量多次纯化，收集主 峰，脱盐、冷冻干燥后得
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