第十节 蛋白质的分离与纯化 一 引言二 蛋白质 酶 分离纯化的前处理三 蛋白质 酶 分离与纯化四 层析技术五 电泳技术六 离心技术 1 一 引言 蛋白质 酶 存在于一切生物体中 是非常重要的生物大分子 蛋白质是生物功能的执行者 担负着生物催化 物质运输 运动 防御 调控及记忆 识别等多种生理功能 2 一 分离纯化的意义 从生物材料中分离制备蛋白质 核酸 研究其结构与功能 对于了解生命活动的规律 阐明生命现象的本质有重大意义 工业生产的需要 食品 发酵 纺织 制革等工业 需要大量的高活性的酶制剂 如用淀粉酶制造葡萄糖 麦芽糖 糊精以及糖浆等 医疗的需要 如用猪胰岛素治疗糖尿病 基因工程的需要 3 二 分离纯化的要求 1 纯度 主要取决于研究的目的和应用上的要求 如作为研究一级结构 空间结构 一级结构与功能的关系的蛋白质制剂 工具酶和标准蛋白 酶法分析的酶制剂 都要求均一 工业 医药方面应用的酶和蛋白质制剂 达到一定纯度即可 不要求均一 2 活性 要求大分子保持天然构象状态 有高度的生物活性 3 收率 希望收率越高越好 但在分离纯化过程中总有不少损失 而且提纯步骤越多 损失越大 4 三 分离纯化的一般程序 生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段 材料的选择和预处理 破碎细胞及提取 有时还需要进行细胞器的分离 分离纯化 包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理 选择材料 破碎细胞 提取 分离纯化 分析及鉴定 5 二 蛋白质 酶 分离纯化的前处理 一 材料的选择与预处理选择材料主要根据实验目的而定 工业生产上注意选择含量高 来源丰富 易获得 制备工艺简单 成本低的动植物***或微生物做原料 科研选材则无需考虑上述问题 只要能达到实验目的即可 实验材料选定后 常常需要进行预处理 如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔*** 脂肪*** 植物种子需要除壳 微生物需要将菌体与发酵液分开 另外 必须尽可能保持材料的新鲜 尽快加工处理 若不立即进行实验或加工 应冷冻保存 6 二 细胞的破碎 分离提取某一生物大分子 首先要求生物大分子从原来的***或细胞中以溶解的状态释放出来 并保持原来的天然状态 不丢生物活性 因此应选择适当的方法将***和细胞破碎 但若材料是体液 如血 或生物体分泌到体外的分泌物 则不必进行***细胞的破碎 ***细胞的破碎方法很多 不同的实验规模 不同的实验材料和实验要求 使用的破碎方法和条件也不同 7 1 机械法 1 研磨 将剪碎的动物***置于研钵或匀浆器中 加入少量石英砂研磨或匀浆 2 ***捣碎器 这是一种较剧烈的破碎细胞的方法 通常可先用家用食品加工机将***打碎 然后再用10000r min 20000r min的内刀式***捣碎机 即高速分散器 将***的细胞打碎 8 2 物理法 1 反复冻融法 将待破碎的细胞冷至 15 到 20 然后放于室温 或40 迅速融化 如此反复冻融多次 由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎 2 ***处理法 此法是借助***的振动力破碎细胞壁和细胞器 破碎微生物细菌和酵母菌时 时间要长一些 3 压榨法 这是一种温和的 彻底破碎细胞的方法 在1000 105Pa 2000 105Pa的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压 细胞将彻底破碎 4 冷热交替法 从细菌或病***中提取蛋白质和核酸时可用此法 在90 左右维持数分钟 立即放入冰浴中使之*** 如此反复多次 绝大部分细胞可以被破碎 9 3 化学与生物化学方法 1 自溶法 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下 细胞结构在自身所具有的各种水解酶 如蛋白酶和酯酶等 的作用下发生溶解 使细胞内含物释放出来 2 溶胀法 细胞膜为天然的半透膜 在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中 由于存在渗透压差 溶剂分子大量进入细胞 将细胞膜胀破释放出细胞内含物 3 酶解法 利用各种水解酶 如溶菌酶 纤维素酶 蜗牛酶和酯酶等 于37 pH8 处理15分钟 可以专一性地将细胞壁分解 4 有机溶剂处理法 利用***仿 甲苯 ***等脂溶性溶剂或SDS 十二烷基硫酸钠 等表面活性剂处理细胞 可将细胞膜溶解 从而使细胞破裂 此法也可以与研磨法联合使用 10 三 细胞器的分离 细胞器包括细胞核 线粒体 核糖体 内质网 植物细胞还有叶绿体 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子 为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染 还需先将细胞器分离出来 然后在某一细胞器中分离某一物质 细胞器的分离一般采用差速离心法 即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心 常用的介质有蔗糖 甘露醇 柠檬酸 聚乙二醇等 各种细胞组分按质量大小的不同 经过不同速度的离心后 沉降于离心管的不同部位 经多次分步离心后 即可获得所需组分 11 四 提取 ***细胞破碎过程中 大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来 必须立即将其置于一定条件下和溶剂中 让制备物充分溶解 并尽可能保持原来的天然状态 避免因长久放置造成制备物的分解破坏 这就是提取 12 1 影响提取的因素 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小 由固相扩散到液相的难易 溶剂的pH值和提取时间等 通常 极性物质易溶于极性溶剂 非极性物质易溶于非极性溶剂 碱性物质易溶于酸性溶剂 酸性物质易溶于碱性溶剂 温度升高 溶解度加大 远离等电点的pH值 溶解度增加 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性 13 2 水溶液提取 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主 用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是 1 盐浓度 即离子强度 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响 绝大多数蛋白质和酶 在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度 如在纯水中加入少量中性盐 蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加 称为 盐溶 现象 盐溶现象的产生主要是少量离子的活动 减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力 增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果 为了提高提取效率 有时需要降低或提高溶剂的极性 向水溶液中加入蔗糖或***可使其极性降低 增加离子强度 如加入KCl NaCl NH4Cl或 NH4 2SO4 可以增加溶液的极性 14 2 pH值 蛋白质 酶的溶解度和稳定性与pH值有关 过酸 过碱均应尽量避免 一般控制在pH 6 8范围内 提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内 通常选择偏离等电点的两侧 3 温度 为防止变性和降解 制备具有活性的蛋白质和酶 提取时一般在0 5 的低温操作 4 防止蛋白酶的降解作用 加入***或调节提取液的pH 离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性 防止它们对欲提纯的蛋白质 酶的降解作用 15 5 搅拌与氧化 搅拌能促使被提取物的溶解 一般采用温和搅拌为宜 速度太快容易产生大量泡沫 增大了与空气的接触面 会引起酶等物质的变性失活 因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基 有些巯基常常是活性部位的必需基团 若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键 导致酶活性的丧失 在提取液中加入少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化 16 3 有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水 稀盐 稀酸 或稀碱中 常用不同比例的有机溶剂提取 常用的有机溶剂有乙醇 *** 异丙醇 正丁酮等 这些溶剂可以与水互溶或部分互溶 同时具有亲水性和亲脂性 有些蛋白质和酶既溶于稀酸 稀碱 又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中 在这种情况下 采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏 并兼有除去杂质提高纯化效果的作用 例如 胰岛素 17 4 膜蛋白的提取 膜蛋白的种类繁多 多数膜蛋白分子数目较少 但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能 根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式 膜蛋白可分为两大类型 外周膜蛋白和内在膜蛋白 1 外周膜蛋白为水溶性蛋白 靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合 因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来 膜结构并不被破坏 2 内在膜蛋白与膜结合非常紧密 一般讲只有用去垢剂 detergent 使膜溶解后才可分离出来 18 膜蛋白即内在蛋白溶解性不好 提取膜蛋白的基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等 最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来 膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂 一般常用的有胆酸盐 Triton 100 Tween 80 SDS等表面活性剂 19 分离膜蛋白的方法 原则性 1 先分离膜 然后提取 如选用冷热交替法 反复冻融法 超声破碎法 玻璃匀浆法 自溶法和酶处理法使得细胞破碎 然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分 2 用特殊的去污剂选择性的分离 在多数情况下 都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来 20 21 三 分离与纯化 从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的 含有大量杂质 必须进一步分离纯化 这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行 蛋白质分离纯化的方法很多 主要是根据蛋白分子之间特异性的差异 如分子大小 溶解度 电荷等建立起来的 22 常用的蛋白质分离纯化技术 溶解度 盐析 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 分子大小 透析 超过滤 密度梯度离心 凝胶过滤 带电特性 电泳 离子交换层析 吸附特性 吸附层析 对配体分子的亲和性 亲和层析 金属螯合层析 分配层析 23 一 粗分级分离 主要是利用盐析法 等电点沉淀 有机溶剂沉淀等方法 使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开 优点 简便 处理量大 既能除去大量杂质 又能浓缩蛋白质 缺点 分辨率低 产品杂质多 24 1 盐析 中性盐沉淀 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为 盐析 除了蛋白质和酶以外 多肽 多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域 已有八十多年的历史 其突出的优点是 成本低 不需要特别昂贵的设备 操作简单 安全 对许多生物活性物质具有稳定作用 25 盐析的基本原理 蛋白质溶液为亲水溶胶体系 其稳定因素 水化膜和电荷 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性 加入大量中性盐后 夺走了水分子 破坏了水化膜 暴露出疏水区域 同时又中和了电荷 破坏了亲水溶胶 蛋白质分子即***而形成沉淀 26 溶解度 盐浓度 Salting out Salting in 27 等点电时的蛋白质 亲水胶体 带负电荷蛋白质 亲水胶体 脱水 脱水 脱水 带负电荷蛋白质 疏水胶体 不稳定蛋白颗粒 ***离子 阳离子 碱 酸 酸 蛋白质***沉淀 带正电荷蛋白质 亲水胶体 碱 水化膜 带正电荷蛋白质 疏水胶体 水化膜 28 中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是 NH4 2SO4 因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点 1 溶解度大 尤其是在低温时仍有相当高的溶解度 这是其他盐类所不具备的 由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定 因而盐析操作也要求在低温下 0 4 进行 由下表可以看到 硫铵在0 时的溶解度 远远高于其它盐类 29 几种盐在不同温度下的溶解度 克 100毫升水 0 20 80 100 NH4 2SO470 675 495 3103Na2SO44 918 943 342 2NaH2PO41 67 893 8101硫铵在0 时的溶解度 远远高于其它盐类 30 2 分离效果好 有的提取液加入适量硫酸铵盐析 一步就可以除去75 的杂蛋白 纯度提高了四倍 3 不易引起变性 有稳定酶与蛋白质结构的作用 有的酶或蛋白质用2 3mol L浓度的 NH4 2SO4保存可达数年之久 4 价格便宜 废液不污染环境 31 3 分段盐析 不同的蛋白质分子 由于其分子表面的极性基团的种类 数目以及排布的不同 其水化层厚度不同 故盐析所需要的盐浓度也不一样 因此调节蛋白质溶液中的盐浓度 可以使不同的蛋白质分别沉淀 血清 球蛋白 清蛋白 NH4 2SO4 50 饱和度 饱和 析出 析出 饱和度 在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度 32 33 4 盐析的影响因素 1 蛋白质的浓度 高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀 若蛋白质浓度过高 易产生各种蛋白质的共沉淀作用 低浓度的蛋白质 共沉淀作用小 但回收率降低 较适中的蛋白质浓度是2 5 3 0 相当于25mg mL 30mg mL 2 pH值对盐析的影响 在等电点处溶解度小 pH值常选在该蛋白质的等电点附近 3 温度的影响 对于蛋白质 酶和多肽等生物大分子 在高离子强度溶液中 温度升高 它们的溶解度反而减小 在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的 一般情况下 可在室温下进行 但对于某些对温度敏感的酶 要求在0 4 下操作 以避免活力丧失 34 2 有机溶剂沉淀法 基本原理有机溶剂对于许多蛋白质 酶 核酸 多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用 是较早使用的沉淀方法之一 其原理主要是 降低水溶液的介电常数 向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数 减小溶剂的极性 从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力 导致蛋白质溶解度降低而沉淀 由于使用的有机溶剂与水互溶 它们在溶解于水的同时 从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子 破坏了蛋白质分子的水膜 因而发生沉淀作用 35 2 有机溶剂沉淀法的优点 分辨能力比盐析法高 即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀 沉淀不用脱盐 过滤比较容易 如有必要 可用透析袋脱有机溶剂 因而在生化制备中有广泛的应用 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活 操作需在低温下进行 36 3 有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶 沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇 甲醇和*** 为了获得沉淀而不着重于进行分离 可用溶液体积的倍数 如加入一倍 二倍 三倍原溶液体积的有机溶剂 来进行有机溶剂沉淀 37 4 有机溶剂沉淀的影响因素 1 温度 多数生物大分子如蛋白质 酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感 温度稍高就会引起变性 且有机溶剂与水混合时产生放热反应 因此必须预冷 操作要在冰盐浴中进行 加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓 一般规律是温度越低 得到的蛋白质活性越高 2 样品浓度 低浓度样品回收率低 要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀 高浓度样品 可以节省有机溶剂 减少变性的危险 但杂蛋白的共沉淀作用大 通常使用5mg mL 20mg mL的蛋白质初浓度为宜 38 3 pH值 选择在样品稳定的pH值范围内 通常是选在等电点附近 从而提高此沉淀法的分辨能力 4 离子强度 盐浓度太大或太小都有不利影响 通常盐浓度以不超过5 为宜 使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的 倍体积为宜 少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用 但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度 降低了沉淀效果 通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质 沉淀所得的固体样品 如果不是立即溶解进行下一步的分离 则应尽可能抽干沉淀 减少其中有机溶剂的含量 如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂 以免影响样品的生物活性 39 3 等电点沉淀法 利用具有不同等电点的两性电解质 在达到电中性时溶解度最低 易发生沉淀 从而实现分离的方法 氨基酸 蛋白质 酶和核酸都是两性电解质 可以利用此法进行初步的沉淀分离 由于许多蛋白质的等电点十分接近 而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度 不能完全沉淀析出 因此 单独使用此法分辨率较低 此法常与盐析法 有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用 以提高沉淀能力和分离效果 40 pH和离子强度对 ***球蛋白溶解度的影响 41 4 选择性变性沉淀法 这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异 选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯 热变性利用生物大分子对热的稳定性不同 加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中 表面活性剂和有机溶剂变性使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀 通常在冰浴或冷室中进行 选择性酸碱变性利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀 通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤 42 5 有机聚合物沉淀法 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂 最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病*** 近年来广泛用于核酸和酶的纯化 其中应用最多的是 聚乙二醇 HOCH2 CH2OCH2 nCH2OH n 4 PolyethyleneGlycol简写为PEG 它的亲水性强 溶干水和许多有机溶剂 对热稳定 有广泛围的分子量 在生物大分子制备中 用的较多的是分子量为6000 20000的PEG 本方法的优点是 操作条件温和 不易引起生物大分子变性 沉淀效能高 使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子 沉淀后有机聚合物容易去除 43 6 透析 自ThomasGraham1861年发明透析方法至今已有一百多年 透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一 在生物大分子的制备过程中 除盐 除少量有机溶剂 除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术 透析只需要使用专用的半透膜即可完成 44 保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为 保留液 袋 膜 外的溶液称为 渗出液 或 透析液 截留分子量MwCO通常为1万左右 用1 BaCl2检查 NH4 2SO4 用1 AgNO3检查NaCl KCl等 45 7 超滤 超过滤即超滤 自20年代问世后 直至60年代以来发展迅速 很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术 超滤现已成为一种重要的生化实验技术 广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子 如蛋白质 酶 核酸等 的浓缩 分离和纯化 超滤是一种加压膜分离技术 即在一定的压力下 使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜 而使大分子溶质不能透过 留在膜的一边 从而使大分子物质得到了部分的纯化 46 加压的蛋白质溶液 浓缩的蛋白质溶液 含小分子的溶液 47 超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同 可分为微孔过滤 超滤和反渗透三种 微孔过滤所用的操作压通常小于4 104Pa 膜的平均孔径为500埃 14微米 1微米 104埃 用于分离较大的微粒 细菌和污染物等 超滤所用操作压为4 104Pa 7 105Pa 膜的平均孔径为10 100埃 用于分离大分子溶质 反渗透所用的操作压比超滤更大 常达到35 105Pa 140 105Pa 膜的平均孔径最小 一般为10埃以下 用于分离小分子溶质 如海水脱盐 制高纯水等 48 二 精分级分离 一般蛋白质样品经粗制分级后 体积较小 杂质大部分被除去 进一步提纯 通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法 常用的柱层析方法有分子筛层析 离子交换层析 疏水吸附层析 亲和层析和金属螯合层析等 常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳等 另外 结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一 制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用 49 第十节 蛋白质的分离与纯化 一 引言二 蛋白质 酶 分离纯化的前处理三 蛋白质 酶 分离与纯化四 层析技术五 电泳技术六 离心技术 50 四 层析技术 层析法也称色谱法 是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的 他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子 各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开 由此得名为 色谱法 Chromatography 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离 1944年出现纸层析 以后层析法不断发展 相继出现气相层析 高压液相层析 薄层层析 亲和层析 凝胶层析等 51 一 层析的分类 按层析的分离机理分类排阻层析 exclusionchromatography 离子交换层析 ionexchangechromatography 吸附层析 absorptionchromatography 分配层析 partitionchromatography 亲和层析 affinitychromatography 金属螯合层析 metalchelatingchromatography 疏水层析 hydrophobicchromatography 反向层析 reversephasechromatography 聚焦层析 focusingchromatography 灌注层析 perfusionchromatography 52 二 排阻层析 凝胶层析 凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法 均称之为排阻层析 用于层析的分离介质称为排阻层析介质 凝胶层析介质主要是以葡聚糖 琼脂糖 聚丙烯酰胺等为原料 通过特殊工艺合成的层析介质 目前已成为生物化学 分子生物学和生物制药的研究和生产中必不可少的分离介质 53 1 凝胶层析的特点及应用 特点 设备简单 操作方便 样品回收率高 实验重复性好 特别是不改变样品生物学活性等优点 用途 蛋白质 包括酶 核酸 多糖等生物分子的分离纯化 同时还应用于蛋白质分子量的测定 脱盐 样品浓缩等 54 2 凝胶层析的原理 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒 凝胶颗粒的内部具有立体网状结构 形成很多孔*** 概念 排阻层析 分子筛层析 当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时 根据它们分子大小不同而进行分离的技术 原理 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构 被分离的混合物流过层析柱时 比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内 在凝胶颗粒之间的空隙向下移动 并最先被洗脱出来 比网孔小的分子能不同程度的***出入凝胶孔内外 在柱内经过的路程较长移动速度较慢 最后被洗脱出来 55 56 57 3 凝胶的种类和性质 1 交联葡聚糖凝胶 Sephadex 1 SephadexGG后的数字为凝胶吸水值的10倍 G反应凝胶的交联程度 膨胀程度和分部范围 2 SephadeXLH 20 是SephadexG 25的羧丙基衍生物 溶于水和亲脂性溶剂 用于分离不溶于水的物质 2 琼脂糖凝胶 Sepharose pharmacia Bio Gel Blo Rad 依靠糖链之间的次级键维持网状结构 琼脂糖密度越大 网状结构越密集 3 聚丙烯酰胺一种人工合成的凝胶 以丙烯酰胺为单位 由甲叉双丙烯酰胺交联而成 交联剂越多 孔隙度越小 商品名为生物胶 P Bio GelP 4 聚丙乙烯凝胶 Styrogel 大网孔结构 58 葡聚糖凝胶 Sephadex 的物理特性 59 4 层析柱的重要参数 柱体积 柱体积是指凝胶装柱后 从柱的底板到凝胶沉积表面的体积 在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶*** 因引柱体积又称 *** 体积 常用Vt表示 外水体积 色谱柱内凝胶颗粒间隙 这部分体积称外水体积 亦称间隙体积 常用Vo表示 60 内水体积 因为凝胶为三维网状结构 颗粒内部仍有空间 液体可进入颗粒内部 这就分间隙的总和为内水体积 又称定相体积 常用Vi表示 不包括固体支持物的体积 Vg 峰洗脱体积 是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积 常用Ve表示 当使用样品的体积很少时 与洗脱体积比较可以忽略不计 在洗脱图中 从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时 洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置 当样品很大时 洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点 或半高处 61 62 5 凝胶过滤在试验室中的应用 1 生物大分子物质的分离纯化2 分子量的测定3 分级分离4 溶液浓缩5 平衡常数的测定6 细胞及颗粒的分离 63 6 分子量的测定 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关 LogM k1 k2Ve Ve为洗脱体积 先测得几种标准蛋白质的Ve 并以其分子量对数对Ve作图得一直线 再测出待测样品的Ve 查标准曲线即可确定分子量 64 三 离子交换层析 根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的 离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质 分子中含有可解离的基团 含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂 可解离出H 含有碱性可解离基团的称为***离子交换树脂 可解离出OH 65 1 离子交换层析的原理 生物大分子如蛋白质 核酸等多价电解质有不同的分子大小及电荷排列方式 当在一定pH下净电荷为负的蛋白质分子可通过静电键结合到带正电荷的***离子交换剂上 当在一定pH下净电荷为正的蛋白质分子可通过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上 大分子依其与离子交换剂亲和力的不同 而在以不同牢度被吸附于离子交换剂 通过改变离子强度或 和 pH使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来 66 67 2 离子交换层析的应用 1 水处理离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子的方法 聚丙乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备 硬水软化以及污水处理等方面 2 分离纯化小分子物质离子交换层析广泛应用于无机离子 有机酸 核苷酸 氨基酸 抗生素等小分子物质的分离纯化 例如对氨基酸的分析使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂 将氨基酸混合液在pH值为2 3上柱 这时氨基酸都结合在树脂上 再逐步提高洗脱液的离子强度和pH值 这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来 可以进行分离鉴定 全自动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成 68 3 分离纯化生物大分子物质离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的 是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段 由于生物样品的复杂性 一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度 往往要与其它分离方法结合使用 使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性 只要选择合适的条件 通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果 69 四 吸附层析 absorptionchromatography 吸附作用是指某些物质能够从溶液中将溶质浓集在其表面的现象 利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团 对流动相中不同溶质产生吸附作用 利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法 称之为吸附层析 固定相为固体 流动相为液体 70 物质之所以能在固体表面停留 这是因为固体表面的分子和固体内部分子所受的吸引力不同 在固体内部 分子之间互相作用的力是对称的 其力场互相抵消 而处于固体表明的分子所收的力是不对称的 向内的一面受到固体内部分子的作用力大 而表面层所受的作用力小 因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响 就会被吸引而停留下来 吸附过程是可逆的 被吸附物在一定条件下可以解吸出来 在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡 称为吸附平衡 吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡 吸附与解吸的动态平衡过程 71 实验中常用的固体吸附剂有氧化铝 硅酸镁 ***酸钙 氢氧化钙 活性钙 蔗糖 纤维素和淀粉 常用的洗脱液有乙烷 苯*** ***仿 以及乙醇 ***或水与有机溶剂形成的各种混合物 吸附层析通常用于分离脂类 类固醇类 类胡罗卜素 叶绿素以及它们的前体等非极性和极性不强的有机物 72 五 分配层析 partitionchromatography 分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术 相当于一种连续性的溶剂抽提方法 在分配层析中 固定相是极性溶剂 例如水 稀硫酸 甲醇等 此类溶剂能和多孔的支持物 常用的是吸附力小 反应性弱的惰性物质如淀粉 纤维素粉 滤纸等 紧密结合 使呈不流动状态 流动相则是非极性的有机溶剂 73 分配系数 是指在一定温度和压力条件下达到平衡 物质在固定相和流动相两部分的浓度比值 74 在层析过程中 当有机溶剂流动相流经样品点时 样品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相向前移动 当经过前方固定相时 流动相中的溶质就会进行分配 一部分进入固定相 通过这样不断进行的流动和再分配 溶质沿着流动方向不断前进 各种溶质由于分配系数不同 向前移动的速度也各不相同 分配系数较大的物质 由于分配在固定相多些 分配在流动相少些 溶质移动较慢 而分配系数较小的物质 流动速度较快 从而将分配系数不同的物质分离开来 75 76 六 亲和层析 AffinityChromatography 许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性 例如 酶与辅酶或酶与底物 产物或竞争性***等 抗原与抗体 凝集素与受体 维生素与结合蛋白 凝集素与多糖 或糖蛋白 细胞表面受体 核酸与互补链 或组蛋白 核酸多聚酶 结合蛋白 以及细胞与细胞表面特异蛋白 或凝集素 等 77 1 亲和层析的原理 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物 称配体 连接到某种固相载体上 并将载有配体的固相载体装柱 当待提纯的生物大分子通过此层析柱时 此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上 其他物质则被冲洗出去 然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来 从而达到分离提纯的目的 78 配体 蛋白质 蛋白质和配体复合物 79 80 2 亲和层析的特点 纯化效率极高 亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合 所以分离提纯的效率极高 提纯度可达几千倍 81 3 亲和层析的应用 1 抗原和抗体利用抗原 抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析 例如将抗原结合于亲和层析基质上 就可以从血清中分离其对应的抗体 抗原 抗体间亲和力一般比较强 其解离常数为10 8 10 12M 所以洗脱时是比较困难的 通常需要较强烈的洗脱条件 82 2 激素和受体蛋白激素的受体蛋白属于膜蛋白 利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质 难于用通常的层析技术分离 但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合 所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力 10 6 10 12M 而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法 目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白 如乙酰胆碱 ***上腺素 生长激素 *** 胰岛素等等多种激素的受体 83 3 凝集素和糖蛋白凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白 几乎都是从植物中提取 它们能识别特殊的糖 因此可以用于分离多糖 各种糖蛋白 免疫球蛋白 血清蛋白甚至完整的细胞 用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法 伴刀豆球蛋白A能结合含 D 吡喃甘露糖苷或 D 吡喃葡萄糖苷的糖蛋白 麦胚凝集素可以特异的与N 乙酰氨基葡萄糖或N 乙酰神经氨酸结合 可以用于血型糖蛋白A 红细胞膜凝集素受体等的分离 洗脱时只需用相应的单糖或类似物 就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来 84 4 多核苷酸和核酸利用poly U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly U结合蛋白 poly A可以用于分离RNA聚合酶以及其它poly A结合蛋白 以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白 DNA聚合酶 RNA聚合酶 核酸外切酶等多种酶类 5 辅酶核苷酸及其许多衍生物 各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子 利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化 例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶 包括AMP cAMP ADP ATP CoA NAD NADP 等等应用很广泛 可以用于分离各种激酶和脱氢酶 85 6 分离病*** 细胞利用配体与病*** 细胞表面受体的相互作用 亲和层析也可以用于病***和细胞的分离 利用凝集素 抗原 抗体等作为配体都可以用于细胞的分离 例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞 胰岛素可以用于分离脂肪细胞等 86 七 金属螯合层析 metalchelatingchromatography 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用 结合在固定相上 二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸 组氨酸 咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法 称之为金属螯合层析 87 金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分离 88 八 高效液相色谱 HPLC 高效液相色谱法是以液体作为流动相 用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术 高效液相色谱对样品的适用性广 不受分析对象挥发性和热稳定性的*** 因而弥补了气相色谱法的不足 目前已知的有机化合物中 可用气相色谱分析的约占20 而80 则需用高效液相色谱来分析 89 1 高效液相色谱法的特点 特点 高压 高效 高速高沸点 热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法 90 2 液相色谱仪 主要部件及流程 91 92 主要部件 1 高压输液泵主要部件之一 压力 150 350 105Pa 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相 10 m 液体的流动相高速通过时 将产生很高的压力 因此高压 高速是高效液相色谱的特点之一 93 2 梯度淋洗装置 外梯度 利用两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 内梯度 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 94 3 进样装置 流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置 其结构如图所示 95 4 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管 内径1 6mm 柱长5 40cm 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效 96 5 高效液相色谱*** 紫外光度*** UV 最小检测量10 9g mL 1 对流量和温度的波动不敏感 可用于梯度洗脱 最常用的*** 97 光电二极管阵列*** 1024个二极管阵列 各检测特定波长 计算机快速处理 三维立体谱图 如图所示 98 3 影响分离的因素 影响分离的主要因素有 固定相及分离柱 流动相的流量 性质和极性 99 1 固定相及分离柱 选择合适的固定相 降低填料粒度可显著提高柱效 但在高效液相色谱中 分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作 一般很少自行制备 选择短柱 细内径提高分析速度 研制高效柱填料是一活跃领域 100 2 流动相及流动相的极性 1 可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要 液相色谱的流动相又称为 淋洗液 洗脱剂 2 亲水性固定液常采用疏水性流动相 即流动相的极性小于固定相的极性 称为正相液液色谱法 极性柱也称正相柱 3 若流动相的极性大于固定液的极性 则称为反相液液色谱 非极性柱也称为反相柱 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反 101 流动相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分 按极性可分为极性 弱极性 非极性 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗 常用溶剂 己烷 四***化碳 甲苯 乙酸乙酯 乙醇 *** 水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性 以改进分离或调整出峰时间 102 4 高效液相色谱法的主要分离类型 1 吸附色谱 液 固吸附色谱 以固体吸附剂为固定相 如硅胶 氧化铝等 较常使用的是5 10 m的硅胶吸附剂 流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂 2 分配色谱 液 液分配色谱 早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相 现多为化学键合固定相 即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面 103 3 离子交换色谱固定相为离子交换树脂 流动相为无机酸或无机碱的水溶液 各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离 4 凝胶色谱 空间排阻色谱 以凝胶为固定相 凝胶是一种经过交联的 具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称 如葡聚糖凝胶 琼脂糖等软质凝胶 多孔硅胶 聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶 104 五 电泳技术 电泳的概念 带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳 electrophoresis 电泳现象早在十九世纪初就已发现 1808年俄国物理学家Re ss进行了世界上第一次电泳实验 但电泳技术的广泛应用 则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后 特别是近几十年以来 电泳技术发展很快 各种类型的电泳技术相继诞生 在生物化学 医学 免疫学等领域得到了广泛应用 105 电泳技术发展简史 1809年俄国物理学家 首次发现电泳现象 他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极 加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊 即带负电荷的粘土颗粒向正极移动 这就是电泳现象 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳 他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点 106 1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进 创造了Tiselius电泳仪 建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法 并首次证明了血清是由白蛋白及 球蛋白组成的 由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法 对氨基酸的分离进行过研究 1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后 开创了利用各种固体物质 如各种滤纸 醋酸纤维素薄膜 琼脂凝胶 淀粉凝胶等 作为支持介质的区带电泳方法 107 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质 创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳 极大地提高了电泳技术的分辨率 开创了近代电泳的新时代 30多年来 聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质 多肽 核酸等生物大分子使用最普遍 分辨率最高的分析鉴定技术 是检验生化物质的最高纯度 即 电泳纯 一维电泳一条带或二维电泳一个点 的标准分析鉴定方法 至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后 最准确的手段 即 LastCheck 80年代发展起来的新的毛细管电泳技术 是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展 己受到人们的充分重视和应用 108 一 电泳的分类 原则上按电泳的原理来分 可分为二类 ***界面电泳 又称移动界面电泳 是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳 其装置复杂 价格昂贵 费时费力 不便于推广应用 区带电泳 是指有支持介质的电泳 待分离物质在支持介质上分离成若干区带 支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散 以使被分离的成分得到最大分辨率的分离 区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异 又可分为不同的类型 109 按支持介质种类的不同 区带电泳可分为 纸电泳 用滤纸作为支持介质 多用于核苷酸的定性定量分析 醋酸纤维素薄膜电泳 医学上 常用于分析血清蛋白 胎盘球蛋白 其优点是简便迅速 便于保存照相 比纸电泳分辨率高 以上二种类型的电泳 由于介质的孔径度大 没有分子筛效应 主要靠被分离物的电荷多少进行分离 110 淀粉凝胶电泳 多用于同工酶分析 凝胶铺厚些 可一层一层剥层分析 一板多测 天然淀粉经加工处理即可使用 但孔径度可调性差 并且由于其批号之间的质量相差很大 很难得到重复的电泳结果 加之电泳时间长 操作麻烦 分辨率低 实验室中已很少使用 琼脂糖凝胶电泳 一般用于核酸的分离分析 琼脂糖凝胶孔径度较大 对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应 聚丙烯酰胺凝胶电泳 可用于核酸和蛋白质的分离 纯化及检测 其分辨率较高 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质 111 二 电泳的基本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动 不同的物质在一定的电场强度下 由于所带电荷不同 因此受到的引力不同 向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的 112 若将带净电荷Q的粒子放入电场 则该粒子所受到的电荷引力为 F引 EQ 1 在溶液中 运动粒子与溶液之间存在阻力F阻F阻 6 r V当F引 F阻时EQ 6 r VV 由上式可以看出 粒子的移动速度 泳动速度V 与电场强度 E 和粒子所带电荷量 Q 成正比 而与粒子的半径 r 及溶液的粘度 成反比 非球形分子 如线状DNA 在电泳过程中受到更大的阻力 即粒子的泳动速度与粒子形状有关 EQ 6 r 2 3 4 113 由 4 可知 带电粒子的泳动速度受电场强度影响 使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同 在一次电泳中 蛋白质处在同一电场中 为了便于比较 常用迁移率m 或称泳动度 指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度 代替泳动速度表示粒子的泳动情况 m V E Q 6 r 5 由上式可以看出 在同一电场中 迁移率仅与球形粒子所带电荷数量 粒子大小及溶液粘度有关 而与电场强度无关 EQ 6 r 4 V 114 以上讨论的是在溶液中进行的***界面电泳的情况 在用支持介质的区带电泳中 除上述影响因素外 有效迁移率还受电渗 是指在电场中 液体对于固体支持物的相对移动 的影响 电泳时应避免用高电渗物质作支持介质 最后要考虑选用离子强度适宜的溶液 离子强度影响粒子的电动电势 溶液的离子强度越高 由于溶液中的离子会分担大部分电流 则粒子的电动电势越小 泳动速度越慢 反之越快 总之 电泳受粒子本身大小 形状 所带电量 溶液粘度 温度 pH 电渗及离子强度多种因素的影响 115 三 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PAGE 是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好 有弹性 透明 化学性质稳定 对pH和温度变化小 没有吸附和电渗作用小的特点 是一种很好的电泳支持介质 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体 acrylamide 简称Acr 和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺 methylanebisacrylamide 简称Bis 在催化剂作用下合成的 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同 主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 双向电泳等类型 116 丙烯酰胺 N N 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 117 1 聚丙烯酰胺凝胶的制备 聚丙烯酰胺凝胶聚合为***基聚合 其催化体系有两种 1 化学聚合化学聚合的催化剂 引发剂 通常采用过硫酸铵 ammoniumpersulfate Ap 此外还需要加速剂TEMED N N N N 四甲基乙二胺 它能以***基的形式存在 微量TEMED的加入 可促使过硫酸铵形成***基 S2O82 2 SO4 这些***基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合 交联反应 形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺 118 2 光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂 核黄素经光照形成无色基 再被痕量氧氧化形成***基 引发聚合反应 TEMED的存在 可以加速聚合 上述聚合反应受许多因素的影响 1 大气氧能淬灭***基 阻止多聚体链长的增加 在进行化学聚合前 一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气 在胶液表面 往往覆盖一层水或溶液 隔绝空气 可加速聚合 2 低温 低pH都会减慢聚合反应速度 3 有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃 一些金属等可抑制聚合反应 119 2 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 凝胶的物理性质如机械强度 弹性 透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度 T 和Acr与Bis两者之比 凝胶总浓度 T 和交联度 C 的计算公式分别为 凝胶孔径大小 主要受凝胶浓度的影响 凝胶浓度越大 孔径越小 凝胶浓度过大 胶硬而脆 易折断 浓度过小 凝胶稀软 不易操作 也易断裂 当凝胶浓度确定后 交联度为5 时 凝胶具有最小孔径 超过5 或低于5 时凝胶孔径都要增大 120 在浓度为7 5 的凝胶中 大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果 因此 把浓度为7 5 凝胶称为标准胶 对于一个未知样品 常用7 5 的标准胶或4 10 的凝胶梯度来测试 而后选出适宜的凝胶浓度 用于研究大分子核酸的凝胶多为2 4 的大孔凝胶 此时凝胶太软 不易操作 可加入0 5 琼脂糖 或在3 凝胶中加入20 蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小 121 3 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
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