1、禽传染性支气管炎病***S1基因与猪IgGFc 基因的***及在Hela 细胞中的融合表达/背景综述目的及意义技术路线研究内容结果与分析致谢/报告提纲/背景综述/病 原 体：IBV（单股正链RNA病***，有囊膜）流行病学：呼吸道排***/飞沫传播；潜伏期短；急性， 高度 接触性；自然感染仅发生 于鸡/雏鸡发 病最为严重；低温是发病的关键。临***症状：损害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统等； 呼吸型、***型、腺胃型等；检测诊断：病***分离、病***中和、血凝抑制试验、RT PCR；ELISA、AGP防 治： 预防为主（环境***），治疗为辅/禽传染性支气管炎(IB)/结合受体，诱导中和抗体、血抑抗体、CTL反应/S蛋白
2、/E蛋白/M蛋白/N蛋白/infectious bronchitis virus IBV/参与病***装配（与核衣壳相互作用，将其结合到囊膜 ）/具有大量抗原决定簇，能诱导产生中和抗体/参与病***粒子的释放/IBV病***粒子结构/背景综述/背景综述/S 蛋白：裂解为S1(90kD)和S2(84kD)的两个亚单位， 均为糖蛋白。S1蛋白：由520538个氨基 酸组成。S1功能：别并结合宿主细胞膜上特异性糖蛋白受体 参与膜融合 氨基端参与决定***株的***亲和性及***力 抑制多数中和抗体/IBV S1蛋白/背景综述/IgG 水解/ 2 Fab +Fc 大小相近/活性不同Fab：结合抗原Fc：结合活化补体 哺***动
3、物IgGFc 段能与SPA、SPG非特异性结合/将目的基因与IgGFc 基因融合表达，利于鉴定和纯化！/免疫球蛋白IgGFc段/IgGFc/目的及意义/***猪IgGFc 和IBV S1基因，为进一步开发以这两个基因为基础的***和诊断方法做基础。 表达S1-IgGFc，以IgGFc为蛋白标签，以期进一步利用亲合层析或免疫沉淀法，进行IBV细胞受体的分离与鉴定 。/技术路线/研究内容/一/ 猪IgGFc 基因的***和序列分析二/ IBV S1基因的***和序列分析三/ 表达载体的构建四/ 重组表达载体在 Hela 细胞上的表达/结果与分析/猪IgGFc 基因扩增/一/ 猪IgGFc 基因的***和序列
4、分析/扩增区域：铰链区C末端 不包括信号肽目的片段：1002 bp 上 游：EcoRI 位点下 游：XhoI 位点/猪IgGFc 基因的RT-PCR扩增/pMD18TIgGFc 构建/图 pMD18T-IgGFc/EcoRI+XhoI酶切/鉴定/EcoRI+ XhoI阳性：2680bp+1002bp/猪IgGFc 基因的***和序列分析/IgGFc 序列分析/测序结果：所获序列(略)1002 bp，与预期一致，无终止子，334个氨基酸Blast比对：100 gi5052049/ gi47523191/ gi43312794% gi33125蛋白预测：分子量大小约37 kD等电点为6/58在体内半
5、衰期约100h，不含跨膜区不含信号肽，与预期相符/猪IgGFc 基因的***和序列分析/二/ IBV S1基因的***和序列分析/IBV S1基因的***/S1基因PCR产物的电泳分析/模板：含M41株S全长的质粒目的：19536氨基酸上游 BamHI，下游EcoRI去掉了信号肽保留裂解识别位点部分碱基，以增加空间距离/pMD18T-S1构建/pMD18T-S1鉴定鉴定/BamHI+EcoRI预期/2680 bp1554bp/pMD18T-S1 BamHI+EcoRI酶切/禽IBVS1基因的***和序列分析/IBV S1序列分析/测序：所获序列（略）大小1554 bp，与预期一致，无中止子，含518个
6、氨基酸Blast：99 AY561712/1 （ M41株S1基因）蛋白预测：稳定蛋白等电点8/17，分子量为58/9 kD，在哺***动物体内半衰期超过30h不含跨膜区没有信号肽/禽IBVS1基因的***和序列分析/三/ 载体构建/载体构建流程图/顺序选择：S1位于上游S1功能区N端/pcDNA3/1-IgGFc 的构建/pcDNA3/1-IgGFc双酶切/XhoI+ EcoRI预期带/5/5kb1kb/pcDNA3/1-IgGFc 经XhoIEcoR I酶切/表达载体的构建/pcDNA3/1-IgGFcS1的构建/BamHI + XhoI/ 5/5kb2/6kbNdeI 酶切鉴定/ 800 bp
7、1600bp5600bp/pcDNA3/1-IgGFcS1/BamHI+XhoI/pcDNA3/1-IgGFcS1/ Nde/表达载体的构建/四/ 重组载体在Hela 细胞上的表达/一抗：兔抗IBV阳性血清二抗：羊抗兔二抗荧光二抗结果：试验组观察到特异性绿色荧光，对照组无绿荧光表明：IBVS1基因在 Hela 细胞中获得了表达，且有活性/间接免疫荧光检测IBV S1基因在Hela 细胞上的表达/IFA检测IBV S1基因的表达/直接检测IgGFc 的表达/方法：直接免疫荧光二抗：羊抗猪二抗结果：试验组有较明显的绿荧光，而对照组无。表明：IgGFc 基因在Hela 细胞内获得表达，且有活性/直接
8、免疫荧光检测IgGFc 基因在Hela 细胞上的表达/重组载体在Hela 细胞上的表达/斑点杂交检测/方法：Dot-blot（直接和间接）裂解液：都能检测到强烈的阳性反应上清：检测不到阳性反应表明：细胞内表达/产物兼具IBV S1和IgGFc 活性/斑点杂交检测IgGFcS1基因在Hela 细胞上的融合表达A/ B/ 为直接检测结果 C/ D/间接检测结果/重组载体在Hela 细胞上的表达/小结/通过RT-PCR从猪***脏总RNA中扩增到 IgGFc 基因，并进行测序和序列分析。PCR扩增得到禽传染性支气管炎病***S1基因 进行测序和序列分析。构建了IBV S1基因和猪 IgGFc 基因融合表达的真核表达载体，并在Hela 细胞上实现了其融合表达。经检测，表达产物主要存在于细胞内，且同时具有IBVS1活性和 IgGFc 活性。/致谢/本论文是在导师郭爱珍教授和谭亚娣副教授的悉心指导下完成的，从论文的选题、试验的设计与实施到论文的写作无不凝聚着导师的智慧和心血。在此，向两位老师表示最诚挚的敬意和忠心的感谢！ 感谢实验室所有老师、同学、工作人员，谢谢你们三年来对我的关心、教导和帮助！/谢谢/谢谢大家/
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